Calculadora de Temperatura de Fusión de Oligos
Estime la temperatura de fusión de un oligo de ADN con dos fórmulas complementarias. La regla de Wallace (4·(G+C) + 2·(A+T)) es rápida y precisa para cebadores cortos (<18 nt); el modelo del vecino más cercano usa un conjunto de parámetros publicados y es preferible para oligos más largos. Ambas respetan una concentración de sodio no predeterminada.
Calculadora
Introduzca una secuencia y calcule para ver la temperatura de fusión
Temperatura de fusión (Tm)
≤ 13 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) · 14–70 nt: Tm = 64.9 + 41 × (G+C − 16.4) / length
Los oligos cortos usan la regla de Wallace (cada par A/T aporta 2 °C, cada par G/C 4 °C). Los oligos largos usan la fórmula básica de GC. Ambos suponen condiciones estándar de baja salinidad — vea las limitaciones bajo la calculadora.
Acerca de este cálculo
Qué es
Tm is the temperature at which half the oligo is single-stranded and half is base-paired with its perfect complement. Below Tm the duplex is favoured; above it, the strands separate. PCR annealing temperatures are set a few degrees below Tm.
Por qué se usa
A working annealing temperature is the difference between a clean band and a smear. The Wallace rule is a quick estimate for short primers; the nearest-neighbour model accounts for sequence context and is the better choice for oligos longer than ~18 nt.
Por qué existe esta calculadora
Both formulas are short, but the salt correction and the choice between methods are easy to slip. The calculator shows the Wallace value, the nearest-neighbour value, and the salt-adjusted versions side by side, so the right number is obvious before you run the PCR.
Supuestos clave
- The oligo is DNA (RNA needs a different parameter set, not provided here).
- The sodium concentration is the monovalent cation concentration in your reaction.
- The oligo has no modified bases or labelled dyes with their own Tm shift.
Limitaciones
- Tm estimates ignore DMSO, betaine, or other PCR additives that change duplex stability.
- The nearest-neighbour parameters are an average across conditions; mismatch prediction requires dedicated software.
- Hairpins and self-dimers can dominate real annealing behaviour for some sequences — use a dedicated tool for those.
Qué calcula
- Temperatura de fusión (Tm) °C
- Estimated temperature at which half of the duplexes are dissociated.
- Longitud nt
- Number of nucleotides in the sequence.
- Contenido de GC %
- Percentage of G and C bases in the sequence.
Preguntas frecuentes
¿Qué es la temperatura de fusión (Tm) de un oligonucleótido?
La Tm es la temperatura a la que la mitad de los dúplex de ADN se ha separado en cadenas sencillas. Depende de la longitud y la composición de bases, con los pares G·C aportando más estabilidad que los A·T. Esta calculadora estima la Tm en °C a partir de una secuencia de 5 a 70 nt e informa la longitud y el contenido de GC junto a ella.
¿Cómo uso la calculadora de Tm de cebadores?
Introduce una secuencia de ADN de cadena sencilla de 5 a 70 nucleótidos usando solo las bases A, C, G y T; la comprobación no distingue mayúsculas y minúsculas. La calculadora devuelve la temperatura de fusión, la longitud y el porcentaje de GC, y elige la fórmula según lo largo del oligo. Los códigos de ambigüedad y las secuencias de más de 70 nt se rechazan en lugar de estimarse.
¿Qué fórmula usa esta calculadora y por qué cambia a las 13 nt?
Los oligos de 13 nt o menos usan la regla de Wallace: 2 °C por cada A/T más 4 °C por cada G/C, la regla práctica 2+4 para cebadores cortos. Los oligos más largos, hasta 70 nt, usan la fórmula básica de GC, 64,9 + 41 × (G+C − 16,4) / longitud, que tiene en cuenta la longitud y el contenido de GC. El recuento simple de Wallace pierde precisión a medida que crecen los oligos, por eso el cambio se hace automáticamente en el límite.
¿Cuál es la diferencia entre temperatura de fusión y temperatura de recocido?
La Tm es una propiedad del dúplex del oligo: la temperatura a la que la mitad está desnaturalizada. La temperatura de recocido (annealing) es la que ajustas realmente en el termociclador para la unión del cebador (primer) durante la PCR, y suele elegirse unos grados por debajo de la Tm del cebador. Esta calculadora solo te da el valor de Tm; no calcula una temperatura de recocido para un protocolo concreto.
¿Por qué mi Tm medida es más alta que el valor de esta calculadora?
Las fórmulas de Wallace y de GC básica son estimaciones empíricas hechas en condiciones de ensayo estándar de unos 50 ng/µL de oligo, bajo catión monovalente y pH cercano a 7, y no aplican ninguna corrección por sales. En condiciones salinas típicas de PCR, como 50 mM de K⁺, la Tm real queda varios grados por encima de lo que reportan estas fórmulas. Tampoco son termodinámica de vecino más cercano ni modelan estructura secundaria, así que para diseños críticos valida con una herramienta de vecino más cercano o una PCR de gradiente.
Solo para uso en investigación y docencia. No destinado a decisiones clínicas o de diagnóstico. Verifique siempre los cálculos de forma independiente antes de usarlos en aplicaciones críticas.