Calculadora de Temperatura de Fusão de Oligos
Estime a temperatura de fusão de um oligo de DNA usando duas fórmulas complementares. A regra de Wallace (4·(G+C) + 2·(A+T)) é rápida e precisa para iniciadores curtos (<18 nt); o modelo do vizinho mais próximo usa um conjunto de parâmetros publicados e é preferível para oligos mais longos. Ambos respeitam uma concentração de sódio fora do padrão.
Calculadora
Digite uma sequência e calcule para ver a temperatura de fusão
Temperatura de fusão (Tm)
≤ 13 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) · 14–70 nt: Tm = 64.9 + 41 × (G+C − 16.4) / length
Oligos curtos usam a regra de Wallace (cada par A/T contribui com 2 °C, cada par G/C com 4 °C). Oligos mais longos usam a fórmula GC básica. Ambos assumem condições padrão de baixo sal — veja as limitações abaixo da calculadora.
Sobre este cálculo
O que é
Tm is the temperature at which half the oligo is single-stranded and half is base-paired with its perfect complement. Below Tm the duplex is favoured; above it, the strands separate. PCR annealing temperatures are set a few degrees below Tm.
Por que é usado
A working annealing temperature is the difference between a clean band and a smear. The Wallace rule is a quick estimate for short primers; the nearest-neighbour model accounts for sequence context and is the better choice for oligos longer than ~18 nt.
Por que esta calculadora existe
Both formulas are short, but the salt correction and the choice between methods are easy to slip. The calculator shows the Wallace value, the nearest-neighbour value, and the salt-adjusted versions side by side, so the right number is obvious before you run the PCR.
Premissas principais
- The oligo is DNA (RNA needs a different parameter set, not provided here).
- The sodium concentration is the monovalent cation concentration in your reaction.
- The oligo has no modified bases or labelled dyes with their own Tm shift.
Limitações
- Tm estimates ignore DMSO, betaine, or other PCR additives that change duplex stability.
- The nearest-neighbour parameters are an average across conditions; mismatch prediction requires dedicated software.
- Hairpins and self-dimers can dominate real annealing behaviour for some sequences — use a dedicated tool for those.
O que é calculado
- Temperatura de fusão (Tm) °C
- Estimated temperature at which half of the duplexes are dissociated.
- Comprimento nt
- Number of nucleotides in the sequence.
- Teor de GC %
- Percentage of G and C bases in the sequence.
Perguntas frequentes
O que é a temperatura de fusão (Tm) de um oligonucleotídeo?
A Tm é a temperatura na qual metade dos duplex de DNA se separou em cadeias simples. Depende do comprimento e da composição de bases, com os pares G·C contribuindo com mais estabilidade que os A·T. Esta calculadora estima a Tm em °C a partir de uma sequência de 5 a 70 nt e informa o comprimento e o conteúdo de GC junto dela.
Como uso a calculadora de Tm de iniciadores?
Informe uma sequência de DNA de fita simples de 5 a 70 nucleotídeos usando apenas as bases A, C, G e T; a verificação não diferencia maiúsculas de minúsculas. A calculadora devolve a temperatura de fusão, o comprimento e a porcentagem de GC, e escolhe a fórmula conforme o comprimento do oligo. Códigos de ambiguidade e sequências com mais de 70 nt são rejeitados em vez de estimados.
Qual fórmula esta calculadora usa e por que ela muda em 13 nt?
Oligos de 13 nt ou menos usam a regra de Wallace: 2 °C por A/T mais 4 °C por G/C, a regra prática 2+4 para iniciadores curtos. Oligos mais longos, até 70 nt, usam a fórmula básica de GC, 64,9 + 41 × (G+C − 16,4) / comprimento, que leva em conta comprimento e conteúdo de GC. A simples contagem de Wallace perde precisão conforme os oligos crescem, por isso a troca é feita automaticamente na fronteira.
Qual é a diferença entre temperatura de fusão e temperatura de anelamento?
A Tm é uma propriedade do duplex do oligo: a temperatura em que metade está dissociada. A temperatura de anelamento (annealing) é a que você realmente ajusta no termociclador para a ligação do iniciador (primer) durante a PCR, geralmente escolhida alguns graus abaixo da Tm do iniciador. Esta calculadora fornece apenas o valor de Tm; ela não calcula uma temperatura de anelamento para um protocolo específico.
Por que minha Tm medida é mais alta que o valor desta calculadora?
As fórmulas de Wallace e de GC básica são estimativas empíricas feitas em condições de ensaio padrão de cerca de 50 ng/µL de oligo, baixo cátion monovalente e pH em torno de 7, sem nenhuma correção de sal. Em condições salinas típicas de PCR, como 50 mM de K⁺, a Tm real fica vários graus acima do que essas fórmulas relatam. Elas também não são termodinâmica de vizinho mais próximo nem modelam estrutura secundária, então para construções críticas valide com uma ferramenta de vizinho mais próximo ou uma PCR em gradiente.
Apenas para uso em pesquisa e ensino. Não destinado a decisões clínicas ou de diagnóstico. Sempre verifique os cálculos de forma independente antes de usos críticos.