Calcolatore di master mix PCR
Inserisci i volumi per reazione di ogni componente del master mix, il numero di reazioni e la frazione di eccesso per coprire le perdite di pipettaggio. Il calcolatore restituisce il volume totale da preparare per ciascun componente — e il volume finale del master mix — con avvisi pratici quando la quantità di stampo o primer supera soglie note di banco.
Calcolatore
Inserisci il tuo mix e calcola per vedere il master mix
Master mix totale (escl. template)
Nota da banco
Per-component volumes
| Componente | µL / rxn | µL totali |
|---|
Inventory check (read-only)
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Vcomponent = Cfinal × Vrxn ÷ Cstock · Vpolymerase = U ÷ (U/µL) · Vwater = (Vrxn − Vtemplate) − ΣV
Il volume di ogni additivo deriva dall'equazione di diluizione C₁V₁ = C₂V₂. La polimerasi è specificata come quantità per reazione (U), quindi il suo volume è semplicemente le unità desiderate divise per la concentrazione stock. L'acqua completa il volume di reazione dopo template e additivi. Ogni volume è poi scalato per (reazioni × fattore di eccesso) per il master mix.
Informazioni su questo calcolo
Che cos'è
Un master mix PCR è una preparazione unica che contiene tutti i reagenti comuni a tutte le reazioni (tampone, dNTP, polimerasi, acqua), aliquotata prima dell’aggiunta dei primer specifici per lo stampo. Preparare un master mix migliora la riproducibilità e fa risparmiare tempo di pipettaggio.
Perché si usa
Effettuare 24, 48 o 96 reazioni un reagente alla volta è lento e soggetto a errori. Un master mix rende ogni provetta di reazione identica tranne che per lo stampo, e l’eccesso per volume morto (tipicamente 5–10 %) evita che l’ultima provetta resti corta.
Perché esiste questo calcolatore
I volumi per reazione sono minuscoli (µL) e piccoli errori si accumulano lungo la piastra. Il calcolatore moltiplica ciascun componente per N e per un fattore di eccesso, e mostra avvisi comuni di banco (percentuale di stampo, concentrazione di primer) facili da tralasciare in un preparativo intenso.
Ipotesi fondamentali
- Ogni reazione usa lo stesso master mix (stessa polimerasi, stessa coppia di primer, stesso volume finale).
- La frazione di eccesso è adeguata al numero di reazioni (un 10 % fisso funziona per ≤50 reazioni).
- Gli stock dei componenti sono alle concentrazioni attese dal calcolatore — verifica prima di scalare.
Limiti
- Non verifica l’appaiamento delle Tm dei primer né la formazione di dimeri — da progettare separatamente.
- Non modella l’ottimizzazione di temperatura di un termociclatore a gradiente.
- Non compensa per reagenti viscosi (es. stock ad alta concentrazione di glicerolo) in cui la precisione di pipettaggio cala.
Che cosa calcola
- Component volumes
- Volume of each additive per reaction and for the whole master mix.
- Nuclease-free water (total)
- Water volume to bring the master mix to the reaction volume.
- Volume totale del master mix
- Combined volume of all additives and water, excluding template.
Domande frequenti
Cos'è un master mix PCR e perché prepararne uno?
Un master mix è un'unica preparazione che contiene tutti i componenti della reazione tranne il DNA stampo — tampone, dNTP, MgCl₂, polimerasi, primer e acqua. Aliquotare un solo miscuglio invece di pipettare ogni reagente in ogni provetta mantiene la composizione di reazione identica tra i campioni e riduce errore e tempo di pipettatura. Questo calcolatore scala una ricetta per reazione a qualsiasi numero di provette e restituisce i µL di ciascun componente per reazione e in totale.
Come uso il calcolatore di master mix PCR?
Inserisci il volume di reazione, il numero di reazioni, il fattore di eccesso e il volume di stampo per provetta, poi imposta la concentrazione di stock e quella finale di ciascun componente: tampone (×/×), dNTP (mM/mM), MgCl₂ (mM/mM), polimerasi (stock in U/µL con le U desiderate per reazione) e entrambi i primer (µM/µM). Il risultato mostra il volume di ogni additivo per reazione e per l'intero master mix, con acqua senza nucleasi a completare il resto. Inserisci 0 come concentrazione finale di un componente opzionale, come MgCl₂ extra o un primer, per escluderlo dal mix.
Cos'è il fattore di eccesso e perché preparare master mix in più?
Il pipettaggio perde un po' di ogni reagente, perciò i laboratori in genere preparano un 5–10 % di mix in eccesso perché all'ultima provetta non manchi nulla. In questo calcolatore l'eccesso è un moltiplicatore applicato a tutta la ricetta: 1,1 prepara il 10 % in più, e i valori accettati vanno da 1 a 10. Ogni componente ed equilibrio di acqua sono scalati per numero di reazioni × eccesso, quindi i totali nel risultato sono i volumi da pipettare nella provetta comune.
Come calcola il calcolatore il volume di ciascun componente?
Ogni additivo basato su concentrazione usa l'equazione di diluizione V = concentrazione finale × volume di reazione ÷ concentrazione di stock, la stessa relazione C1V1 usata al banco. La polimerasi fa eccezione: inserisci una quantità in unità per reazione contro uno stock in U/µL, quindi il suo volume è unità ÷ concentrazione di stock. L'acqua viene bilanciata per sottrazione — volume di reazione meno stampo meno tutti gli additivi.
Perché il DNA stampo non è incluso nel master mix?
Lo stampo è l'unico componente che differsce tra le provette, quindi viene aggiunto a ogni provetta separatamente dopo aver distribuito il master mix. Inserisci comunque il volume di stampo per provetta, perché il calcolatore lo sottrae nel bilanciare l'acqua così che mix più stampo equivalgano al tuo volume di reazione. Se gli additivi non stanno nello spazio rimasto dopo lo stampo, il calcolatore segnala un errore e chiede di aumentare il volume di reazione o ridurre le concentrazioni dei componenti.
Solo per uso didattico e di ricerca. Non destinato a decisioni cliniche o diagnostiche. Verificare sempre i calcoli in modo indipendente prima di usi critici.