PCRマスターミックス計算ツール

よくある質問

• PCRマスターミックスとは何か、なぜまとめて作るのですか。

  マスターミックスとは、テンプレートDNAを除くすべての反応成分(バッファー、dNTP、MgCl₂、ポリメラーゼ、プライマー、水)を一括して作った単一の調製液です。各チューブに試薬を個別にピペッティングする代わりに一つのmixを分注すれば、サンプル間で反応組成が同一に保たれ、ピペッティングの誤差と時間が減ります。本ツールは1反応あたりのレシピを任意の本数のチューブへスケールし、各成分の1反応あたりと合計のµL量を返します。

• PCRマスターミックス計算ツールはどう使いますか。

  反応容量、反応数、過剰係数、チューブあたりのテンプレート容量を入力し、各成分のストック濃度と最終濃度を設定します:バッファー(×/×)、dNTP(mM/mM)、MgCl₂(mM/mM)、ポリメラーゼ(U/µLのストックに1反応あたりの希望U数)、両プライマー(µM/µM)。結果には各添加量の1反応あたりとマスターミックス全体の容量が表示され、残り容量はヌクレアーゼフリー水で満たされます。任意成分(追加のMgCl₂やプライマーなど)をmixから除外するには、その最終濃度に0を入力してください。

• 過剰係数とは何ですか。なぜマスターミックスを余分に作るのですか。

  ピペッティングでは各試薬が少しずつ失われるため、多くのラボでは最後のチューブが不足しないよう5〜10%多めにmixを用意します。本ツールでは過剰分はレシピ全体に乗じる係数で、1.1なら10%多く作り、許容値は1〜10です。各成分も水のバランスも「反応数×過剰係数」でスケールされるため、結果の合計値がまとめチューブへピペッティングする容量になります。

• 計算ツールは各成分の容量をどのように求めますか。

  濃度ベースの添加量はすべて希釈の式 V=最終濃度×反応容量÷ストック濃度で求めます。これはベンチで使うC1V1の関係と同じです。ポリメラーゼは例外で、ストックはU/µLで入力し1反応あたりのユニット数を指定するため、容量はユニット数÷ストック濃度になります。水は引き算で調整します。反応容量からテンプレートとすべての添加量を引いた値です。

• テンプレートDNAはなぜマスターミックスに含めないのですか。

  テンプレートはチューブごとに異なる唯一の成分なので、マスターミックスを分注したあとで各チューブに個別に加えます。それでもチューブあたりのテンプレート容量を入力するのは、水をバランスする際に計算機がこれを差し引き、mix＋テンプレートが反応容量ちょうどになるようにするためです。添加量がテンプレート後の空き容量に収まらない場合、計算機はエラーを返し、反応容量を増やすか成分濃度を下げるよう案内します。